Schedl-laboratorio

IPTG-induktio ja proteiinien uuttaminen bakteereista

, jotka on valmistanut Swathi Arur ja Sudhir Nayak

induktio bakteereissa voidaan suorittaa jommallakummalla kahdesta perusmenetelmästä. Nopea induktio ei tehoa kaikkiin proteiineihin ja voi antaa suboptimaalisia saantoja. Hidas induktio voi parantaa joidenkin proteiinien liukoisuutta. Menetelmä, joka on paras sinulle riippuu tietyn proteiinin ja sovelluksen. Jos haluat optimaalisen liukoisuuden, molemmat on testattava ennen skaalausta. Tämä protokolla on yleistynyt ja vaihtelee useiden tekijöiden, kuten bakteerikannan, rekombinanttiproteiinin ja lähtöplasmidin perusteella.

nopea induktio

1) suhteellisen tuoreelta levyltä (<4 viikkoa) poimi pesäke ja kasvata O/N 30C: ssä (tai 37C: ssä) 1-2 ml: n LB+AMP: ssa (tai muussa valinnassa) 15 ml: n napsahdusputkessa rotaattorilla tai ravistimella.

2) laimennetaan 1:50 (1:100, jos 37C O/N) 2 ml: n LB+AMP: iin ja kasvatetaan 3-4 tuntia 37 C: n lämpötilassa 15 ml: n nap cap-putkessa rotaattorissa.

4) Valmista 1 ml LB+AMP+1mm IPTG 15 ml: n kartiomaiseen ja esilämmittyy 37 C: hen noin 10min ennen käyttöä.

5) 3-4 tunnin kuluttua poistetaan 1 ml putkista 37seg C: n lämpötilassa ja asetetaan merkittyihin 1, 5 ml: n putkiin. Pyöräytä Max, 30sec, RT ja poista supe. Jäädyttää pelletti -20 kunnes tarvitaan. TÄMÄ ON KOULUTTAMATON KONTROLLI.

6) Lisää valmiiksi aseistettu 1ml LB+AMP + 1mm IPTG 15ml: n snap cap-putkeen ja palaa 37 C: hen 3-4 tunniksi. Näin lopullinen tilavuus palautuu 2 ml: aan ja IPTG: n lopullinen pitoisuus 0, 5 mM: iin.

7) 3-4 tunnin kuluttua siirrosta 1 ml indusoidusta näytteestä merkittyihin 1, 5 ml: n putkiin ja spin Max, 30sec, RT, ja poista supe. Jäädyttää pelletti -20 kunnes tarvitaan. TÄMÄ ON INDUSOITU NÄYTE.

8) näytteen valmistelu SDS-Pagelle: lisätään 100ul 1X: n kuormituspuskuria (KS.alla olevat liuokset) 1%: lla BME: tä johtamattomiin ja indusoituihin näytteisiin. Vortex varten 10sec 1min tai kunnes ei ole möhkäleitä bakteereja. Keitetään 3-5min, spin max, 30sec, RT, ja kuormitus 5-25ul (yleensä 10ul) riippuen geelistä (proteiinin määrä, pelletin koko, Länsi, jne.).

hidas induktio

proteiinin hidas induktio seuraa nopeaa induktiokäytäntöä seuraavin muutoksin:

6) lisätään 20 C 1 ml LB+AMP + 1mm IPTG 15 ml: n snap cap-putkeen ja inkuboidaan pyörimistä tai ravistelua 20 C: ssa 12-16 tuntia. Näin lopullinen tilavuus palautuu 2 ml: aan ja IPTG: n lopullinen pitoisuus 0, 5 mM: iin.

7) 12-16 tunnin kuluttua siirrosta 1 ml indusoidusta näytteestä merkittyihin 1, 5 ml: n putkiin ja spin Max, 30sec, RT ja Supe poistetaan. Jäädyttää pelletti -20 kunnes tarvitaan. TÄMÄ ON INDUSOITU NÄYTE.

INDUKTIOHUOMAUTUKSET:

* Induktioajat vaihtelevat 2-5 tunnin välillä.

* IPTG voi vaihdella välillä 0, 1-1, 0 M.

*jos näytettä keitetään liian kauan, siitä tulee viskoosia solun DNA: n täydellisen vapautumisen vuoksi. Voit silti käyttää niitä, jos löydät alueen alhainen viskositeetti, kuitenkin sen yleensä parempi vain toistaa kokeen.

liukoisten proteiinien uuttaminen

1) Pese bakteeripelletti 2mls: llä jääkylmää STE: tä (10mm Tris, pH 8.0; 150mm Nacl; 1mm EDTA) kerran.

2) suspendoidaan bakteeriselletti (10 ml: n indusoidusta viljelmästä) 800UL: aan STE: tä, joka sisältää 100ug/ml lysotsyymiä (lisätty juuri ennen sekoittamista)

3) inkuboidaan jäällä 15 minuutin ajan.

4) lisätään DTT lopulliseen pitoisuuteen 5 mm ( meillä varastot ovat 1M in -20).

5) Lisää proteaasinestäjät.

6) bakteerit lysytetään lisäämällä n-lauryylisarkosiinia (Sarkosyyliä) STE: N 10-prosenttisesta (w/v) kannasta. N-lauryylisarkosiinin lopullisen pitoisuuden tulee olla 1, 5%.

7) sonikoi solut pienessä kylpyammeessa 2 syklin ajan (6min kukin). Sonicator sammuu automaattisesti 6 minuutin kuluttua.

8) sentrifugoidaan lysaattia 5 minuutin ajan lämpötilassa 4 C.

9) siirretään supernatantti uuteen Eppendorf-putkeen ja lisätään Triton X-100 (STE: ssä valmistetusta 10%: n varastosta) lopulliseksi pitoisuudeksi 2%.

10) Ota 100ul ni-NTA-agaroosigeeliä ja pese kahdesti sentrifugoimalla jääkylmällä PBS: llä 1000rpm: ssä 1 minuutin ajan. jokainen

11) lisää Helmet lysaattia ja Triton X-100-putkea sisältävään Eppendorf-putkeen ja inkuboi NUTAATTORILLA tai keinutuolilla RT: n kohdalla 30-60min.

12) pese Helmet 4X 1 ml jääkylmällä PBS: llä, joka sisältää 20mm imidiatsolia 1000rpm: ssä 1 minuutin välein.

13) lisätään 1x latauspuskuri 1% BME: llä, keitetään 3min ja analysoidaan SDS-sivulla.

notes for extraction:

*tämä perusprotokolla toimii lippu -, GST-ja 6HIS-epitooppitunnisteille. Sitä ei ole testattu MBP: llä, joka ei reagoi tahtoon pesuaineissa.

* Imidiatsolin sisällyttäminen on spesifistä 6HIS-tunnisteelle.

* TWEEN20 0, 1-1% voidaan tarvittaessa sisällyttää myös pesupuskuriin taustan vähentämiseksi.

liuokset

Kuormituspuskuri (4-kertaisen kannan muodostamiseksi)

50 mM Tris-HCl; pH 6, 8 (2, 0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0, 8 g SDS)

10% glyserolia (4, 0 ml 10% glyserolia)

12, 5 mM EDTA (1, 0 ml 0, 5 M EDTA)

0, 02% Bromofenolisinistä (8 mg Bromofenolisinistä)

lisää tuore 2(tai beeta)-merkaptoetanoli (BME) 1% ennen käyttöä.