Schedl Lab

IPTG Induction et extraction de protéines à partir de bactéries

Préparé par Swathi Arur et Sudhir Nayak

L’induction chez les bactéries peut être réalisée en utilisant l’une des deux méthodes de base. L’induction rapide ne fonctionne pas pour toutes les protéines et peut vous donner des rendements sous-optimaux. Une induction lente peut améliorer la solubilité de certaines protéines. La méthode qui vous convient le mieux dépendra de votre protéine particulière et de l’application. Si vous souhaitez une solubilité optimale, les deux doivent être testés avant la mise à l’échelle. Ce protocole est généralisé et variera en fonction d’une variété de facteurs tels que la souche bactérienne, la protéine recombinante et le plasmide parent.

Induction rapide

1) À partir d’une plaque relativement fraîche (< 4 semaines), choisissez une colonie et cultivez O / N à 30C (ou 37C) dans 1-2ml LB + AMP (ou autre sélection) dans un tube à capuchon de 15ml sur un rotateur ou un agitateur.

2) Diluer 1: 50 (1: 100 si 37C O / N) dans 2 ml LB + AMP et cultiver 3-4 heures à 37 C dans un tube à capuchon de 15 ml dans un rotateur.

4) Préparer 1ml LB + AMP + 1mm IPTG dans un conique de 15ml et préchauffer à 37 C environ 10min avant utilisation.

5) Après 3 à 4 heures, retirer 1 ml des tubes à 37 degrés C et les placer dans des tubes de 1,5 ml étiquetés. Tourner à max, 30sec, RT et retirer supe. Congeler la pastille à -20 jusqu’à ce que cela soit nécessaire. C’EST LE CONTRÔLE NON INDUIT.

6) Ajouter 1ml LB + AMP + 1MM IPTG pré-réchauffé au tube à capuchon de 15ml et revenir à 37 C pendant 3-4 heures. Cela ramènera le volume final à 2 ml et la concentration finale d’IPTG à 0,5 mM.

7) Après 3 à 4 heures, transférez 1 ml de l’échantillon induit vers des tubes de 1,5 ml marqués et essorez à max, 30sec, RT et retirez supe. Congeler la pastille à -20 jusqu’à ce que cela soit nécessaire. C’EST L’ÉCHANTILLON INDUIT.

8) Préparation de l’échantillon pour la PAGE SDS: Ajoutez 100ul de tampon de chargement 1X (voir solutions ci-dessous) avec 1% de BME aux échantillons non induits et induits. Vortex pendant 10sec à 1min ou jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’amas de bactéries. Faites bouillir 3-5min, essorez à max, 30sec, RT et chargez 5-25ul (généralement 10ul) en fonction du gel (quantité de protéines, taille de la pastille, Western, etc.).

Induction lente

Pour l’induction lente de la protéine, suivez le protocole d’induction rapide avec les modifications suivantes:

6) Ajouter 20 C 1ml LB + AMP + 1mm IPTG au tube à capuchon de 15 ml et incuber en tournant ou en agitant à 20 C pendant 12 à 16 heures. Cela ramènera le volume final à 2 ml et la concentration finale d’IPTG à 0,5 mM.

7) Après 12 à 16 heures, transférez 1 ml de l’échantillon induit vers des tubes de 1,5 ml marqués et essorez à max, 30sec, RT et retirez supe. Congeler la pastille à -20 jusqu’à ce que cela soit nécessaire. C’EST L’ÉCHANTILLON INDUIT.

NOTES pour l’induction:

* Les temps d’induction varient de 2 à 5 heures.

* L’IPTG peut varier de 0,1 à 1,0 M.

* Si vous faites bouillir votre échantillon trop longtemps, il deviendra visqueux à la suite de la libération totale d’ADN cellulaire. Vous pouvez toujours les utiliser si vous trouvez une zone de faible viscosité, cependant, il est généralement préférable de répéter l’expérience.

Extraction des protéines solubles

1) Laver le culot bactérien avec 2 ml de STE glacé (Tris de 10 mm, pH 8,0; Nacl de 150 mm; EDTA de 1 mm) une fois.

2) Remettre en suspension le culot bactérien (issu d’une culture induite de 10ml) dans 800ul de STE contenant 100ug/ml de Lysozyme (ajouté immédiatement avant la remise en suspension)

3) Incuber sur glace pendant 15 minutes.

4) Ajouter la TNT à une concentration finale de 5mM (nous avons des stocks à 1M en -20).

5) Ajouter des inhibiteurs de protéase.

6) Les bactéries sont ensuite lysées par addition de N-laurylsarcosine (Sarkosyl) à partir d’un stock de 10% (p/v) dans STE. La concentration finale de N-lauryl sarcosine doit être de 1,5%.

7) Sonicate les cellules dans le petit sonicateur à bain pendant 2 cycles (6min chacun). Le sonicateur s’éteint automatiquement après 6 minutes.

8) Centrifuger le lysat pendant 5min à 4 C.

9) Transférer le surnageant dans un nouveau tube d’eppendorf et ajouter du Triton X-100 (à partir d’un stock de 10% fabriqué en STE) à une concentration finale de 2%.

10) Prendre 100ul de gel d’agarose Ni-NTA et laver deux fois par centrifugation avec du PBS glacé à 1000 tr/ min pendant 1min. chaque

11) Ajouter les billes dans le tube eppendorf contenant le lysat et le tube Triton X-100 et incuber sur un nutator ou un rocker à TA pendant 30-60min.

12) Lavez les perles 4X avec 1 ml de PBS glacé contenant de l’imidiazole de 20 mm à 1000 tr / min pendant 1 minute chacune.

13) Ajoutez 1X tampon de chargement avec 1% de BME, faites bouillir 3min et analysez sur la PAGE SDS.

NOTES pour l’extraction:

* Ce protocole de base fonctionnera pour FLAG, GST et 6SES étiquettes épitopes. Il n’a pas été testé pour le MBP, qui ne répond pas aux détergents.

* L’inclusion d’Imidiazole est spécifique à 6SES étiquettes.

* TWEEN20 à 0,1-1% peut également être incorporé dans le tampon de lavage pour réduire le fond si nécessaire.

Solutions

Tampon de chargement (Pour faire un Stock 4X)

50 mm Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1M Tris-HCl; pH 6.8)

2% FDS (0,8 g FDS)

Glycérol à 10% (4,0 ml de glycérol à 10%)

EDTA à 12,5 mM (1,0 ml d’EDTA à 0,5 M)

0,02% Bleu de bromophénol (8 mg de bleu de bromophénol)

Ajouter frais 2 (ou bêta) – mercaptoéthanol (BME) à 1% avant utilisation.