Schedl Lab

IPTG induktion og ekstraktion af proteiner fra bakterier

fremstillet af Shathi Arur og Sudhir Nayak

induktion i bakterier kan udføres ved hjælp af en af to grundlæggende metoder. Hurtig induktion virker ikke for alle proteiner og kan give dig suboptimale udbytter. Langsom induktion kan forbedre opløseligheden af nogle proteiner. Den metode, der er bedst for dig, afhænger af dit særlige protein og applikationen. Hvis du vil have optimal opløselighed, skal begge testes, før du skalerer op. Denne protokol er generaliseret og vil variere baseret på en række faktorer, såsom bakteriestammen, rekombinant protein og moderplasmid.

hurtig induktion

1) fra en relativt frisk plade (< 4 uger) vælg en koloni og voks O/n ved 30C (eller 37C) i 1-2 ml LB+AMP (eller andet valg) i et 15 ml snaphætterør på en rotator eller ryster.

2) fortynd 1:50 (1:100 hvis 37C O/N) i 2 ml LB+AMP og vokse 3-4 timer ved 37 C i 15 ml snap cap tube i en rotator.

4) Forbered 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG i en 15 ml konisk og forvarme til 37 C omkring 10 minutter før brug.

5) Efter 3-4 timer fjernes 1 ml fra rørene ved 37deg C og anbringes i mærkede 1,5 ml rør. Spin ved maks, 30 sek, RT, og fjern supe. Frys pellet ved -20, indtil det er nødvendigt. DETTE ER DEN UINDUCEREDE KONTROL.

6) Tilsæt forvasket 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG til 15 ml snap cap tube og vend tilbage til 37 C i 3-4 timer. Dette får det endelige volumen tilbage til 2 ml og den endelige koncentration af IPTG til 0,5 mM.

7) efter 3-4hrs overførsel 1 ml fra induceret prøve til mærkede 1,5 ml rør og spin ved maks, 30sec, RT, og fjern supe. Frys pellet ved -20, indtil det er nødvendigt. DETTE ER DEN INDUCEREDE PRØVE.

8) prøveforberedelse til SDS-PAGE: Tilføj 100ul 1 gang loading buffer (se opløsninger nedenfor) med 1% BME til uinducerede og inducerede prøver. Hvirvel i 10 sek til 1min eller indtil der ikke er klumper af bakterier. Kog 3-5min, spin ved maks, 30sec, RT og belastning 5-25ul (normalt 10UL) afhængigt af gel (mængde protein, størrelse af pellet, vestlig osv.).

langsom induktion

til langsom induktion af protein følg hurtig induktionsprotokol med følgende ændringer:

6) Tilsæt 20 C 1 ml LB+AMP+1 mm IPTG til 15 ml snap cap tube og inkuber roterende eller rystende ved 20 C i 12-16 timer. Dette får det endelige volumen tilbage til 2 ml og den endelige koncentration af IPTG til 0,5 mM.

7) efter 12-16 timer overføres 1 ml fra induceret prøve til mærkede 1,5 ml rør og spin ved maks., 30 sek, RT og fjern supe. Frys pellet ved -20, indtil det er nødvendigt. DETTE ER DEN INDUCEREDE PRØVE.

noter til induktion:

*Induktionstider varierer fra 2-5 timer.

*IPTG kan varieres fra 0,1-1,0 M.

*hvis du koger din prøve for længe, bliver de viskøse fra total frigivelse af cellulært DNA. Du kan stadig bruge dem, hvis du kan finde et område med lav viskositet, men det er normalt bedre bare at gentage eksperimentet.

ekstraktion af opløselige proteiner

1) Vask bakteriepellet med 2 ml iskold STE (10 mm Tris, pH 8,0; 150 mm Nacl; 1 mm EDTA) en gang.

2) Opbland bakteriepelleten (fra en 10 ml induceret kultur) i 800UL STE indeholdende 100ug/ml Lysosym (tilsat umiddelbart før resuspension)

3) inkuberes på is i 15 minutter.

4) Tilføj DTT til en endelig koncentration på 5 mm ( Vi har lagre på 1 m i -20).

5) Tilføj proteasehæmmere.

6) bakterier lyseres derefter ved tilsætning af N-laurylsarcosin (Sarkosyl) fra en 10% (vægt/v) bestand i STE. Den endelige koncentration af N-lauryl sarcosin bør være 1,5%.

7) Sonicate cellerne i den lille bad sonicator med i 2 cyklusser (6min hver). Sonicatoren slukker automatisk efter 6 minutter.

8) centrifuger lysatet i 5 minutter ved 4 C.

9) Overfør supernatanten til et nyt Eppendorf-rør og tilsæt Triton H-100 (fra en 10% bestand fremstillet i STE) til en endelig koncentration på 2%.

10) Tag 100ul Ni-NTA agarosegel og vask to gange ved centrifugering med iskold PBS ved 1000rpm i 1min. hver

11) Tilføj perlerne til Eppendorf-røret, der indeholder lysatet og Triton H-100-røret, og inkuber på en nutator eller vipper ved RT i 30-60min.

12) vask perlerne 4 gange med 1 ml iskold PBS indeholdende 20 mm imidiasol ved 1000 rpm i 1 minut hver.

13) tilføj 1 gange lastning buffer med 1% BME, kog 3min, og analysere på SDS-side.

noter til udvinding:

*denne grundlæggende protokol vil arbejde for FLAG, GST, og 6his epitope tags. Det er ikke blevet testet for MBP, som ikke reagerer vilje til vaskemidler.

*inkluderingen af Imidium er specifik for 6HIS tags.

*DISKANT20 ved 0,1-1% kan også inkorporeres i vaskebufferen for at reducere baggrunden, hvis det kræves.

opløsninger

Loading Buffer (til fremstilling af et 4 gange lager)

50 mM Tris-HCl; pH 6,8 (2,0 ml 1m Tris-HCl; pH 6.8)

2% SDS (0, 8 g SDS)

10% Glycerol (4, 0 ml 10% Glycerol)

12, 5 mM EDTA (1, 0 ml 0, 5 M EDTA)

0, 02% Bromphenolblå (8 mg Bromphenolblå)

tilsæt frisk 2(eller beta)-mercaptoethanol (BME) til 1% Før brug.